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PCR PARA CDV POR TRANSCRIPCIÓN REVERSA
La muestra de sangre debe ser conservada en EDTA hasta por 5 días. Mediante centrifugación de esta sangre, se sapara la capa de leucocitos (buffy coat) que es el material utilizado para la extracción del RNA del virus distemper. El volumen de sangre es importante, para aumentar la cantidad de RNA aislado obtenido de la muestra.

El método de extracción se basa en la lisis de las células y de la cápside viral para la liberación del mRNA contenido en ésta y la separación del del RNA con solventes.  El RNA presente en la fase acuosa se purifica por adsorción en columna de matriz para RNA. La concentración de RNA obtenido en la solución final puede determinarse por espectrofotometría a 296nm.


MUESTRA:   SANGRE CON EDTA > 1 mL

 

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EXTRACCIÓN  DEL RNA

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El mRNA purificado de la muestra es utilizado  posteriormente para la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante Transcripción Reversa. En este proceso intevienen el RNA aislado (molde), la enzima Transcriptasa Reversa (de leucemia murina), cebadores de DNA, RNAasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y buffers.

El primer 1 se une a la cadena de RNA, y mediante la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena cDNA, resultando una molécula híbrida. A continuación, mediante la actividad de la enzima RNAasa H, se degrada el RNA viral que fué utilizado como molde.

El primer 2 se une al cDNA monocatenario para sintetizar la hebra complementaria y se procede a la correspondiente elongación mediante la actividad de la DNA polimerasa.

La amplificación del DNA que se ha sintetizado, se consigue mezclándolo con los primers de complentaridad específica al extremo 3´ del DNA, los cuales actuan como iniciadores para la actividad de la polimerasa. En esta solución deben también estar presentes los dNTPs que son las unidades que componene el DNA, en una mezcla equimolar, y la TAq polimerada (enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus).

Esta síntesis exponencial de DNA por RT-PCR incluye 3 pasos:

1. Desnaturalización o separación de las hebras del DNA (94°C x 1,0 min)
2. Alineamiento o apareamiento de los primers a la región complementaria del DNA (59,5°C x 2,0 min)
3. Extensión o síntesis del nuevo DNA idéntico, mediante la actividad de la polimerasa (72°C x 1,0 min)

Estos pasos se repiten automáticamente unas 40 veces en un termociclador, para crear millones de copias del fragmento del DNA, derivado de la transcipción del RNA del virus distemper.


TRANSCRIPCIÓN REVERSA, REPLICACIÓN, AMPLIFICACIÓN


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